生物组 郑 利
从近几年我省高考命题热点及比例来看，高中生物选修内容比例为8%到10%，即8到10分，而选修中PCR扩增技术、基因工程等则是选修中的重点和难点，而且又是高考中的命题热点，下面主要以设问的形式对PCR扩增技术的相关知识考点加以梳理和强调。
一、基本及常规考点
1.什么是PCR扩增技术?
聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
2. PCR扩增技术的基本原理是什么？
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，即DNA双链复制原理 （或半保留复制，碱基互补配对原则），其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
3.PCR扩增技术的基本步骤是什么？
PCR由高温变性——低温退火复性——适温引物延伸三个基本反应步骤构成：
模板DNA的变性主要是通过加热(与体内DNA复制时解旋酶作用相同)至93℃左右（90-95℃）一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性) 即温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；而引物的延伸则是DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。为防止模板核酸变性不彻底，通常在变性之前需进行预变性。
4.PCR反应条件是什么?
PCR技术的反应条件，除了模板、原料（dNTP）、ATP、TaqDNA聚合酶、与模板结合的特异性引物以外，至少还需要三个条件即液体环境、适宜的温度和酸碱度，温度可由PCR仪自动调控，而酸碱度则靠缓冲液（Mg2+）来维持。
5.PCR扩增技术的优点是什么？
PCR扩增技术的优点是特异性强、灵敏度高，简便、快速，对标本的纯度要求低。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染，易推广。
其中特异性强主要取决于：①引物与模板DNA特异性的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。
6.生物体内DNA复制和PCR反应都需要模板、四种脱氧核苷酸、能量、酶，且都需要在一定环境中进行，不同点体现在哪些方面？
①氢键断裂方式不同，体内DNA复制时也解旋，在解旋酶的作用下进行，不能加热，而PCR反应中的氢键断裂则是通过高温加热来完成的；②所需引物不同，前者的引物为RNA片段，后者可以是RNA片段也可以是单链DNA片段；③合成子链的连续性不同，体内复制时先是在引物基础上一条链连续合成，一条链不连续合成，而PCR反应分别从两条链的引物端开始，都是连续合成的；④DNA聚合酶的稳定性不同，后者需要耐高温的TaqDNA聚合酶；⑤循环次数不同，前者受生物体自身控制，后者一般可循环30多次。循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
７.通常在什么情况下使用PCR扩增技术作为体外合成目的基因的方法？
①需要对目的基因片段大量扩增时；②目的基因片段自身的核苷酸序列未知或部分未知时；③已知目的基因片段两端的一段脱氧核苷酸序列。
二、易考及引申考点
从近两年全国各地的高考试题对选修的考察难度来看，选修部分知识的考查难度有明显的提高，而不再是最初的提纲挈领式以及纯记忆式考察，因而必须对选修的相关专题板块特别是基因工程的相关知识加以深化，全面布网，充分备战高考。如2011年江苏卷33题中就深化考察了引物的设计要求、PCR反应产物的类型及比例等相关引申考点，难度有所加大。
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列（不包含目的基因片段），就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR技术就可将模板DNA在体外大量扩增。
1.PCR技术有关引物的考点：
（1）DNA的复制中需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3?端延伸DNA链。因而引物的作用是与模板的3?端结合，提供DNA延伸的起始位点，DNA聚合酶的作用是从引物的3?端开始催化DNA链的延伸。
（2）设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：通常为15-30bp，常用数为20bp左右。
②G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带，G+C含量偏低时延伸子链时的温度不能偏高。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
③避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3 ׳ 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
④引物3′ 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求与模板链配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑤引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑥引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列（如目的基因序列）无明显同源性。
⑦引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
(3)PCR技术中需要引物的种类和数量：
引物种类通常为两种，且分别与最初的两种原始模板链两端的DNA片段互补，故又称引物对；若1个含有目的基因的DNA片段通过PCR扩增技术经n次循环，根据半保留复制的原理需两种引物共２ｎ+1-2个（两种引物量相等，所有DNA分子片段的每条链除最初的两条模板链外均含有引物）。
2.PCR技术经若干次循环后出现的含有目的基因的DNA片段类型的种类和比例的相关考点：
设最初的与引物Ａ和引物Ｂ结合的模板链分别为模板链Ａ（最长）和模板链Ｂ（最长），经第一轮循环后形成的两个ＤＮＡ分子分别只含引物Ａ和引物Ｂ，且两条脱氧核苷酸链不等长，故为两种不同的ＤＮＡ分子，分别记为类型①和②，而参与第二次循环的模板链除最初的两条（最长）模板链外，新增的两条模板链分别记为（较长）模板链Ｃ（右侧只含引物Ａ,右侧起点固定，不等长）和（较长）模板链Ｄ（左侧只含引物Ｂ,左侧起点固定，不等长），如图一。则以模板链Ｃ和Ｄ为模板合成的２个子代ＤＮＡ分子均同时含引物Ａ和Ｂ，但每个ＤＮＡ分子的上下两条链不等长，分别记为类型③（同时含引物Ａ和Ｂ，且引物Ａ链较长）和④（同时含引物Ａ和Ｂ，且引物Ｂ链较长）,故第二次循环会产生类型①和②各１个，类型③和④各１个，而类型③和④中新合成的链分别记为（最短）模板链Ｅ（只含引物Ｂ,且左右两端序列是固定的）和（最短）模板链Ｆ（只含引物Ａ,且左右两端序列是固定的）；经第三次循环１个类型①ＤＮＡ分子片段复制完成会产生1个①和１个③，１个类型②ＤＮＡ分子片段复制完成会产生1个②和１个④，而１个类型③ＤＮＡ分子片段复制完成会产生1个③和１个新的ＤＮＡ分子片段记为类型⑤（同时含有引物Ａ和Ｂ，且两条链等长），而１个类型④ＤＮＡ分子片段复制完成会产生1个④和１个类型⑤，即经过第三次循环可以产生５种类型的ＤＮＡ分子片段，或者８个ＤＮＡ分子，分别是类型①和②各１个，类型③和④各２个，类型⑤２个。第四次循环中新增的2个类型⑤DNA分子又可合成4个相同的类型⑤DNA分子，故一共合成的DNA分子片段分别是1个①，1个②，3个③，3个④，8个类型⑤。
如此进行下去，则经ｎ次循环，共合成２ｎ个ＤＮＡ分子，分别是类型①（只含引物Ａ）和类型②（只含引物Ｂ）各１个，分别占１／２ｎ，类型③（同时含引物Ａ和Ｂ，且引物Ａ链较长）和④（同时含引物Ａ和Ｂ，且引物Ｂ链较长）各ｎ－１个，各占（ｎ－１）／２ｎ，类型⑤（同时含有引物Ａ和Ｂ，且两条链等长且最短）２ｎ－２ｎ个，所占比例为１－２ｎ／２ｎ。且２ｎ个ＤＮＡ分子中，始终只有２个ＤＮＡ分子只含引物Ａ或Ｂ，其余的均同时含引物Ａ和Ｂ。
第一次循环产物为两种类型，第二次循环产物为四种类型，第三次循环产物中开始出现第５种类型，且比例随循环次数增加而增加，但并非指数性增加。
如果掌握了以上规律，再温故一下2011年的这道高考题，学生做起来就会得心应手，游刃有余。
附 （2011年江苏卷部分）33．请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如上图所示）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。
②在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组：__________； ②第2组：__________。
答案：
(1) ①15/16 ②三
(2) ①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；②引物I'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
通过上述的分析推导归纳就可以将松散的知识点整体化，琐碎的知识点系统化，复杂易考的知识点规律化，便于记忆以及缩短解题时间。
因此，在紧张的高三复习阶段，作为教师既要善于发现教材中的潜在的知识点，又要引导学生适时地总结归纳提升；作为学生自己既要及时的掌握理解老师所讲授的相关知识精髓，又要善于并乐于应用到实战中去。只有这样才能让高考复习达到事半功倍的效果。
（李道兵老师编审）
